Et specialtog, der kører fra Antarktis til junglen, kan ophøre med at eksistere, og årsagen skyldes forringelsen af jernbaneskinnerne. Dyrene, der var bange for at miste den eneste transport, der tillader dem at rejse, henvendte sig til Diego for at få hjælp på Go Diego Go! Diego's Railroad Rescue. Drengen er klar til at hjælpe og involverer dig i gennemførelsen af hans plan. Det involverer reparation af vejen, men først skal du sætte alle dyrene i vognene. Passagerer accepterer kun at rejse i selskab med deres egen slags, så der er en separat vogn til pingviner, hjorte, bjørne og så videre. Når alle dyrene er placeret, vil toget begynde sin rejse, og før hvert stop skal du samle vejen som et puslespil ved at dreje individuelle sektioner i Go Diego Go! Diego's Railroad Rescue.
