Alt ændrer sig over tid, og Mario's verden har også ændret sig. Hvis alle fjender tidligere var kendt, og der ikke var så mange af dem, er de nu blevet skjult og farligere. I Super Mario Vs Mafia bliver vores modige blikkenslager nødt til at møde en stor mafia -gruppe. Udadtil er det solide fyre i sorte dragter, men faktisk er de rigtige banditter, desuden grusomme og nådesløse. Hjælp helten med at håndtere alle kriminelle. Du vil sandsynligvis se et kraftfuldt håndvåbenvåben i heltens hænder for første gang. Lageret af ammunition på hvert niveau vil ændre sig afhængigt af situationen, men det vil altid være mindre end nødvendigt. Derfor skal hvert skud nå målet. Med en kugle kan helten ødelægge flere banditter på samme tid, hvis de er på samme bane eller ved hjælp af en ricochet i Super Mario Vs Mafia.